确定氧化磷酸化偶联部位通常用两种方法。
(一)P/0值测定
P/0值指在氧化磷酸化过程中消耗一克原子氧所消耗的无机磷的克原子数，或者说消耗一克原子氧所生成的ATP的克分子数。P/0值实质上指的是呼吸过程中磷酸化的效率。
测定P/0值的方法通常是在一密闭的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧饱和的缓冲液，再加入线粒体制剂时就会有氧化磷酸化进行。反应终了时测定O2消耗量(可用氧电极法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以计算出P/0值了。在反应系统中加入不同的底物，可测得各自的P/0值，结合我们所了解的呼吸链的传递顺序，就可以分析出大致的偶联部位了。
表6-3 离体线粒体的P/0比值
| 底物 | 呼吸的组成 | P/0比值 | 生成ATP数 |
| （1）β-羟丁酸 | NAD+→FMN→CoQ→Cyt→O2 | 2.4-2.8 | 3 |
| （2）琥珀酸 | FAN→CoQ→Cyt→O2 | 1.7 | 2 |
| （3）抗坏血酸 | Cyt→Cytaa3→O2 | 0.88 | 1 |
| （4）细胞色素c | Cytaa3→O2 | 0.61-0.68 | 1 |
从上表可以看出P/0值为小数，由于线粒体的偶联作用在离体条件下不能完全发挥，故可认为实际的ATP生成数是他们所接近的正整数值。
比较表中的(1)和(2)，呼吸链传递的差异是在CoQ之间，两者ATP的生成数相差1，所以这个ATP的生成部位一定在NAD→CoQ之间。
比较表中(2)和(3)，呼吸链传递的差异是在Cyt c之间，两者ATP的生成数相差1，所以这个ATP的生成部位在CoQ→Cyt c之间。
比较表中(3)和(4)，生成的ATP数均为1，呼吸链传递的区别是在Cyt c→Cyt aa3，故Cytc→ aa3不存在偶联部位，而在Cyt aa3→O2之间存在着一个偶联部位。
