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(2)培养：培养基于接种前必须处于无氧状态。为达到此目的，可：①初代培养用的平板应新鲜配制，4h内用完;或放人充以二氧化碳的不透气密封塑料袋中，4℃保存，1～2天内用完;②用前放入无氧环境，使预还原24～48h;③用预还原厌氧灭菌法配制的培养基，即在整个配制和分装过程中均通入二氧化碳，使培养基不接触氧;④液体培养基使用前煮沸10mm。驱除溶解其中的氧气，迅速冷却后立即接种。非选择性培养基：目前最常用者为牛心脑浸出液和布氏菌肉汤两种基础培养基，加入氯化血红素5μ/ml、维生素K110μg/ml、0.5%酵母浸出液、5%～10%羊血等制成血平皿，分别为BHIB和BRU，几能培养出所有厌氧菌。原上海医科大学与上海生物制品研究所合作试制的厌氧菌干燥培养基，经广泛应用，效果良好。选择性培养基：利用选择性培养基，可在众多的细菌中，选出主要的致病菌，可根据标本的来源，选择相应的培养基。目前常用的选择性培养基有：①卡那霉素-万古霉素溶血平皿(KVLB)。可抑制多数兼性厌氧菌，使产黑素普氏菌早期形成黑色素;如用于选择卟啉单胞菌属，万古霉素的浓度以2ng/ml或以下为宜(原配方中的浓度为7.5ng/m1);②类杆菌胆汁七叶苷琼脂(BBE)，脆弱类杆菌组细菌和死亡梭杆菌能耐胆汁，并能水解七叶灵，使培养基呈黑色，菌落周围有黑晕;③卵黄琼脂(EYA)，用于选择产气荚膜梭菌;④苯乙醇血琼脂(PEA)，抑制变形杆菌和其他肠杆菌科细菌，有利于厌氧菌的生长;⑤环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(CCFA)，选择艰难梭菌;⑥改良Fm培养基，选择梭杆菌;⑦乳酸钠培养基，选择韦荣球菌等。在标本接种前，如能先进行直接涂片染色镜检，以了解细菌的形态和染色性，初步估计标本中的可能细菌，再选用培养基将更具针对性。厌氧菌中的放线菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属和消化链球菌属等都有不少菌种或菌株为微需氧菌，通过用同一菌落分别在有氧、无氧或5%～10%二氧化碳环境中进行培养的耐氧试验(aerotolerancetest)，可测出各种细菌对氧的需求，而命名为需氧、厌氧、微需氧等不同类型的细菌。厌氧菌接种后应放入厌氧培养装置和仪器以维持厌氧环境。目前临床常用的厌氧培养装置有厌氧培养罐(anaerobicjar)，或厌氧缸、厌氧袋和厌氧箱或厌氧室(chamber)三种系统，三者对临床常见厌氧菌的检出率基本相同，但以厌氧培养罐最简便实用，厌氧培养罐可用泵抽气充气或化学方法去除操作环境中的游离氧，而以N2(80%)，CO2(10%)、H2(10%)取代，建立厌氧环境。H2在催化剂(氧化钯)存在的情况下，可与残留的氧化合而形成水。罐中可放亚甲蓝作指示剂。接种后的培养基置厌氧环境中孵育，48h后进行初次检查。如无生长继续孵育，同时再接种一平皿进行孵育，两者均无生长者作为阴性，故培养一般需1周以上才能作出结论。
(3)鉴定：厌氧菌的常规鉴定包括菌落形态、溶血性、色素产生、经紫外线照射有无荧光现象、菌落涂片、染色和镜检、生化反应、动力、毒力试验等;其中糖发酵试验为基本的生化反应，常规采用试管法，培养基用量大，需时长，目前已发展微量、快速、商品化的鉴定系统。国外有专供厌氧菌鉴定的多种检测系统和快速鉴定系统，使厌氧菌的鉴定标准化，并可与微机联用逐步自动化。已有下列几种鉴定系统：①推断性平皿(presumptoplates)：是由美国CDC实验室Lombard与Dowell两学者设计制成，故亦称LD琼脂，乃将多种试验集合制成专门比的平皿培养基，称为推断性平皿(pp)，pp共有pp1、pp2、pp3三种。每一种平皿划分为四个区、三个平皿共12个区(包括pp1的LD琼脂和七叶苷、卵黄与胆汁，pp2的DNA、葡萄糖、牛乳与淀粉。以及pp3的甘露醇、乳糖、鼠李糖与明胶等琼脂)可测定厌氧菌的18种不同特性。纯培养接种于pp后需在厌氧环境下孵育48h后观察结果，对照厌氧菌的分类特征，和该商品所提供的鉴定表格可作出推断性鉴定。②生化微量鉴定系统(biochemical-basedminisystem)：其所进行的试验与常规检验系统测试者大多相同。但制成小形塑料条或盘。例如APl20A即为一塑料长盒，内有20个，内置试剂用以检测细菌的吲哚生成、触酶、尿素酶、七叶苷水解、明胶液化和对16种糖的发酵活力;使用本系统时，细菌混悬液加入内后需置厌氧环境中孵育24～48h，观察结果，读数可查对生产者提供的电码本。③细菌已形成酶活性的微量鉴定系统(pre-existingenzyme-basedminisystem)，采用小形塑料板或卡。细菌已形成的酶与微量基质(酶作用物)作用后能发生迅速反应，菌液加入板上的内后无须置厌氧环境孵育，4h即可观察结果，已有AN-IDENT(21种试验)、RapidANAⅡ(18种试验)、Microscan(24种试验)等系统生产。
